ポスターセッション

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酵母の色彩によるAPC遺伝子変異の検出法の確立：古内恵司^１、浜田淳一^１、秋田弘俊³、三品孝行³、樋田康浩^１、古内奈留美^１、外木秀文^１、細川眞澄男²、守内哲也^１(北大・医・^１癌研細胞制御、²病理、³一内）

Development of detection system for APC mutation by using color of S. cerevisiae: Keiji FURUUCHI^１, Jun-ichi HAMADA^１, Hirotoshi AKITA^１, Takayuki MISHINA³, Yasuhiro HIDA^１, Narumi FURUUCHI^１, Hidefumi TONOKI^１, Masuo HOSOKAWA², Tetsuya MORIUCHI¹ (Div. of ^１Cell Biol., ²Pathol., Cancer Inst., ³1st Dept. Med., Hokkaido Univ. Scl. of Med.)

【目的】APC遺伝子の異常は、大腸癌をはじめ、多くの癌の発癌および悪性化に関与している。APC cDNAが8.5kbpの巨大な分子のため、既存の方法による遺伝子変異の検索は困難であった。APCの遺伝子変異には、停止コドンを生じる変異が非常に多いことに着目し、酵母の色彩で変異の有無を判別する方法を確立した。
【方法・結果】APC cDNAを５つの領域に分割し、それぞれのcDNAを酵母のADE2遺伝子にin-frameに連結して融合蛋白発現ベクターを作製した。次いで、それぞれのベクターを制限酵素で処理し、cDNAの中間部をくり抜いてギャップベクターを作製した。まず、APC遺伝子の変異型細胞株(DLD1)からRNAとDNAを抽出し、RT-PCR(エクソン1-14)及びPCR(エクソン15)で5つ領域を増幅した。そして、各PCR産物とギャップベクターを同時に酵母に導入した結果、両者とも変異を含む領域のアッセイでのみ酵母コロニーは全て赤色となった。同様に、野生型細胞株(HCT116)用いた結果、酵母コロニーは全て白色となった。次に、HCT116とDLD1を一定比率で混合してアッセイを行った結果、赤コロニーの割合は DLD1の比率に比例した。そして、非小細胞肺癌とFAP患者の大腸ポリープを対象にアッセイを行った結果、１症例ずつナンセンス変異が証明された。
【考察】全長8.5kbpにわたるAPC cDNAのナンセンス変異、フレームシフト変異を鋭敏にしかも簡便に検出する方法が確立できた。これによって癌に於けるAPC変異の解析が進むことが期待される。